羊肉的品性特质商酌日益受到趣味，肉质性状包括pH、肉色、大理石纹、系水力、嫩度、多汁性和肌内脂肪含量等女同 porn，在影响肉质的繁密身分中，肌内脂肪含量是影响羊肉肉质性状的进犯身分。肌内脂肪含量受脂肪细胞的数目以及体积影响，在热量摄入加多的情况下，白色脂肪组织和会过加多现存脂肪细胞的大小和通过前体脂肪细胞酿成新的脂肪细胞而扩大，从而导致脂肪细胞数目加多[1-3]。肌内脂肪千里积受多种身分烦嚣，连年来，转录因子对脂肪千里积调控的商酌越来越多。

核受体超家眷是一大群转机机体生理稳态与特定干系的转录因子。天然该组中的好多核受体已被充分表征，然则存在大齐且束缚加多的具有未知功能或配体的受体，称为孤儿核受体[4-6]。核受体家眷成员NR4A1(nuclear receptor subfamily 4 group a member 1)，也被称为Nur77、TR3和NGFI-B，散播在多种细胞内，具有功能各样性，对多种生理经过齐发扬着进犯作用[7]，包括细胞增殖和凋一火等人命当作[8-12]。在细胞凋一火的商酌中，Liu等[13]的商酌结果标明，烦嚣素刺激基因12a(ISG12a)极度互相作用伴侣NR4A1均参与肿瘤坏死因子干系凋一火教诲配体(TRAIL)介导的肝癌细胞凋一火；Yang等[14]商酌发现，Nur77通过与谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)启动子上的特定结合位点结合来增强GPX1启动子的反式激活，从而上调GPX1的抒发，进而保护胰腺β细胞凋一火。同期，NR4A1也有抗细胞增殖的作用，有商酌解释，NR4A1/3通过平直结合造血特异性C/EBPα增强剂并激活C/EBPα转录，部分地通过激活C/EBPα驱动的抗增殖汇聚来罢休HSC增殖[15]；Hedrick等[16]商酌发现，在横纹肌赘瘤(RMS)中过抒发概况烦嚣Nur77或用Nur77拮抗剂(DIM-C-pPhOH)均对RMS细胞有抗增殖作用。NR4A1也具有转机线粒体的功能，Zhu等[17]商酌发现，NR4A1/DNA-PKcs/p53阶梯参与了乳酸加快血管钙化的机制，部分原因是过度的Drp介导的线粒体裂变和线粒体促凋一火卵白基因干系的线粒体穷乏；Sheng等[18]商酌发现，NR4A1烦嚣打断了线粒体外膜受体干系的线粒体裂变，并取消了帕金森介导的线粒体吞吃，从而减少了高血糖介导的线粒体毁伤，改善了肾功能。线粒体是有氧呼吸产生能量的主要塞点，而上述商酌标明，NR4A1不错转机线粒体的功能，标明NR4A1可能与能量稳态干系。在脂肪方面的商酌，秦丹丹[19]商酌发现，过抒发NR4A1可禁锢小鼠的脂肪细胞分化，同期有商酌标明，烦嚣Nur77可下调HFD饲喂雌性小鼠白色脂肪组织的乙酰辅酶A羧化酶α(ACCα)和脂肪酸(FAS)，进一次序控脂肪代谢[20]，Jung等[21]商酌发现，用Nur77禁锢剂禁锢3T3-L1前脂肪细胞的脂肪酿成，伴跟着在脂肪酿成早期发生的有丝分裂克隆扩增(MCE)减少， 以及MCE和细胞周期记号物所需的基因抒发缩小；Yi等[22]商酌得到，NR4A1的低抒发不错缩小2型糖尿病小鼠的体重、血脂和血糖，何况脂肪细胞的大小和脂滴的体积相应减小。上述商酌标明，过抒发NR4A1不错禁锢脂肪细胞分化，烦嚣其抒发一样会禁锢脂肪细胞的分化，但其具体调控机制需要进一步探讨。现在尚未见NR4A1对山羊皮下脂肪细胞影响的商酌报谈。

基于上述的不同商酌结果，本检修在克隆山羊NR4A1 cDNA序列的基础上，运用qPCR本领检测NR4A1基因在山羊不同组织和不同分化阶段皮下脂肪细胞中的抒发模式，何况探讨过抒发NR4A1对山羊皮下脂肪细胞的影响，为进一步商酌NR4A1基因在皮下脂肪细胞分化中的作用提供基础数据，并为最终叙述其调控山羊皮下脂肪千里积的分子机制奠定基础。

本商酌以1周岁健康的简州大耳羊(n=5)为检修动物，黎明空心24 h，宰杀后采集心、肝、脾、肺、肾、皮脂、腹脂、背最长肌、股二头肌和臂三头肌等组织。

Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司；Kpn Ⅰ和Not Ⅰ内切酶购自Thermo公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit、Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司。

1.3.1 山羊NR4A1克隆及生物信息学分析 　　凭据GenBank中的山羊估量序列(XM_018047733.1)联想克隆引物(表 1)。先用RT-PCR本领对NR4A1基因进行克隆，PCR反映体系：5倍稀释的背最长肌cDNA模板1 μL，12.5 μL的2×GC Rich-PCR，1 μL的正义链引物(10 μmol·μL-1)和1 μL的反义链引物(10 μmol·μL-1)，补充ddH2O至25 μL。克隆步调: 98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，64 ℃退火15 s，72 ℃延长40 s，35个轮回；72 ℃延长5 min；4 ℃保存。PCR居品用2% 琼脂糖凝胶进行电泳，用Gel Extraction Kit回收预备片断；构建pClone007载体后荡漾DH5α感受态细胞；挑取阳性菌落进行PCR果决并索求质粒，然后测序。

通过ProtParam在线分析编码卵白的理化性质；通过NCBI网站的ORF Finder寻找盛开阅读框(open reading frame， ORF)；承袭STRING估量NR4A1卵白与其他卵白的互相作用汇聚；使用Conserved Domains (CD)估量卵白结构域。

1.3.2 山羊NR4A1的组织抒发分析 　　凭据上述克隆得到的NR4A1 CDS区序列联想qPCR引物，凭据山羊不同内参基因的筛选，选拔泛抒发转录因子(UXT)和肽酰脯氨基顺反异构酶(PPIB)为内参基因[23]，qPCR的引物信息如表 1所示。以上述采集的山羊组织样进行总RNA索乞降cDNA的合成，以分析NR4A1基因在山羊不同组织的相对抒发水平。通过qPCR本领检测NR4A1基因在山羊不同组织的抒发量，qPCR体系: SYBR ® Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，5倍稀释的cDNA 1 μL，1 μL的正义链引物(10 μmol·μL-1) 和1 μL的反义链引物(10 μmol·μL-1)，补充ddH2O至20 μL。qPCR步调: 95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延长30 s，共39个轮回。

1.3.3 山羊NR4A1的细胞时序抒发分析 　　在无菌条目下从7日龄的简州大耳羊均分离出山羊的皮下脂肪组织(n=1)。先将分离出的肌肉组织切碎，用PBS冲洗3次，然后加入2倍体积的Ⅱ型胶原酶，接下来通过补充有10% 胎牛血清(FBS)调换体积的DMEM / F12(Hyclone)远离消化，并别离通过400目筛。将悬浮液以2 000 r·min-1离心5 min，加入红细胞(RBC)融解液，然后以2 000 r·min-1离心5 min。皮下脂肪细胞的千里淀被DMEM/F12(Hyclone)和FBS重悬。将皮下前体脂肪细胞接种在细胞培养瓶中，4 h后更换培养基，每2 d更换1次培养基。当传至F3代的细胞长至80%知道时，添加油酸教诲液进行分化，并别离网罗第0、12、36、60和96 h的细胞。用qPCR方法分析NR4A1基因在山羊不同时刻段皮下脂肪细胞的相对抒发水平。反映体系同“1.3.2”。

1.3.4 过抒发载体的构建 　　运用上述克隆得到的NR4A1 CDS区联想亚克隆引物，NR4A1-S: CGGGGTACC ATGCCCTGTATCCAAGCCC，NR4A1-A: ATAAGAATGCGGCCGCTCAGAAGGGCAG TGTGTCC。以上述索求的质粒为模板，以上述联想的引物进行PCR扩增，将片断邻接到19T载体后测序，质粒索求纯化后用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，胶回收居品运用T4邻接酶邻接，之后荡漾到DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落并进行PCR果决，对果决正确的菌凄凉求质粒进行测序。

1.3.5 NR4A1过抒发成果以及细胞花式学的检测(油红O染色) 　　运用“1.3.3”的方法，细胞传至F3代时，加入适量载体，空缺检修组以空载体感染皮下前体脂肪细胞，检修组以pcDNA3.1-NR4A1感染皮下前体脂肪细胞，感染2 d后网罗细胞。转染体系：100 μL opti，1.5 μL Lipofectamine 3000，500 ng pcDNA3.1-NR4A1。

通过花式学(油红O染色)检测转染过抒发载体后山羊皮下脂肪细胞的脂质含量变化情况。将油红O液加入蒸馏水配成油红O染色液，皮下脂肪细胞用10%甲醛溶液固定30 min后移除甲醛溶液，并用200 μL油红O染色液浸泡，染色后用PBS洗涤，于显微镜下不雅察山羊皮下脂肪细胞的脂滴花式。终末用250 μL异丙醇索求细胞内脂质，并测量490 nm处的吸光度。

1.3.6 过抒发NR4A1对脂肪分化记号基因抒发的影响 　　运用qPCR本领检测过抒发NR4A1对脂肪分化记号基因抒发量的影响。反映体系参照“1.3.2”。

1.3.7 统计分析 　　用“平均值±程序差(Mean±SD)”的形貌来暗示数据，用2-ΔΔCt方法对qPCR定量数据进行分析[24]。通过SPSS 15.0软件进行权贵性分析和多重比较，当P < 0.01时以为互异极权贵。

本检修得手克隆得到山羊NR4A1基因CDS区序列，长度为1 797 bp(登录号为MN19754 4)。经过ORF Finder分析发现，山羊NR4A1的ORF为1 797 bp，编码598个氨基酸，不踏实指数为60.06，亲水性的平均值为－0.269，表面等电点是6.85，带负电荷的氨基酸残基总和为58个，带正电荷的氨基酸残基总和为57个，通过CD在线软件分析得到山羊NR4A1具有1个锌指结构，1个DNA结构位点。山羊与绵羊的亲缘关系最近，与原鸡属关系最远，基本合适生物进化论(图 1A)；山羊的氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列相似性最高，其次为东谈主，相似性最低为原鸡属(图 1B)。

本检修检测了NR4A1在山羊不同组织中的相对抒发水平。以UXT为内参，心组织样本为校准样本，得到NR4A1基因在组织中的抒发模式，发现NR4A1在山羊肺组织中抒发较高(P < 0.01)，在山羊背最长肌中抒发最高(P < 0.01)，在扫数被检测10种组织中均有抒发(图 2)。

为了获取NR4A1基因在山羊皮下脂肪细胞的抒发模式，本检修还检测了NR4A1在山羊不同时刻段皮下脂肪细胞中的抒发量，NR4A1基因在皮下脂肪细胞分化0~60 h的抒发量牢固飞腾，在60 h达到最高(P < 0.01)，60 h后开动下跌(图 3)。

运用NR4A1过抒发载体检测其对山羊皮下前体脂肪细胞的影响，qPCR结果表露，与对照组比拟，NR4A1基因抒发量上调了5 493倍(图 4A)。油红O染色表露，与对照组比拟，过抒发NR4A1后彰着促进山羊皮下脂肪细胞脂质结合(图 4C)，何况油红O染色索求结果表露，过抒发后OD值极权贵升高(P < 0.01，图 4B)。

为了进一步叙述山羊NR4A1对皮下脂肪细胞分化的调控机制，本商酌检测了过抒发NR4A1对脂肪细胞干系基因相对抒发水平的影响。结果表露，过抒发山羊NR4A1后C/EBPα、C/EBPβ、LPL、PPARγ、SREBP1、AP2在山羊皮下脂肪细胞中的抒发量权贵飞腾(P < 0.05，图 5)。

本商酌得手克隆了山羊NR4A1基因CDS区序列，通过STRING软件分析发现， FOS、AKT2卵白与NR4A1互作，Kokoroishi等[25]商酌报谈，FOS不错促进TGF-β1介导的信号传导，进一次序节脂肪分化；Pang等[26]商酌标明，AKT2不错禁锢脂肪的生成，由此揣摸，NR4A1基因可能与脂肪和脂肪酸代谢调控密切干系。为卓著到NR4A1在山羊的组织特异性，因此本检修商酌了NR4A1在山羊的组织抒发模式，结果得到，NR4A1在背最长肌中抒发水平最高，在肺组织中抒发次之，在扫数被检测的山羊10种组织中均有抒发。结果与其他学者在其他物种中的报谈存在相似或不同之处，Liu等[27]商酌发现，NR4A1在猪的肝、胃和肌肉等组织中的相对抒发水平很低；Nakai等[28]商酌发现，NR4A1在东谈主类胎儿肌肉和成东谈主肝、大脑和甲状腺中日常抒发。基于上述报谈结合本实验室结果揣摸，NR4A1基因组织抒发具有物种和组织特异性。

本商酌发现，NR4A1在山羊皮下前体脂肪细胞分化中呈先飞腾后下跌的趋势，且过抒发NR4A1促进山羊皮下脂肪细胞的分化，揣摸NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪细胞分化的正调控因子。与本检修结果一致的是，Fumoto等[29]发现，NR4A1在3T3-L1细胞中瞬时过抒发会促进脂质的积聚。然则，Veum等[30]商酌发现，NR4A1在东谈主原代前体脂肪细胞分化时当前调，而本商酌发现，NR4A1在山羊脂肪细胞前期分化上调，而在60 h后才出现下调的繁荣；何况，Qin等[31]商酌标明，过抒发NR4A1通过增强GATA结合卵白2(GATA2)和p53的抒发禁锢小鼠脂肪细胞的分化和脂质积聚；Chao等[32]发现，过抒发NR4A1不错禁锢3T3-F442A前体脂肪细胞的分化。上述这些报谈与本商酌的结果存在不同之处，由此揣摸，NR4A1基因在不同物种的脂肪细胞调控经过中可能存在物种特异性。

本商酌进一步检测了过抒发NR4A1对山羊脂肪细胞分化记号基因抒发的影响，结果表露，过抒发NR4A1后脂肪分化记号基因的相对抒发量飞腾。能量代谢的主要形貌是富含三酰基甘油的脂卵白(TRL)水解，开释可使用或存储的脂肪酸，这是通过在血管内皮的“结合脂解部位” LPL完了的[33]；PPARγ是脂肪酿成的主要教诲剂，C/EBPβ是教诲脂肪生成的早期转录因子，它通过转机其附进启动子元件的转录来激活PPARγ，而PPARγ是脂肪细胞分化的正转机剂[34]，在之前的一些报谈中，C/EBPα均以被解释为脂肪细胞分化的要道基因，此外，它还不错转机AP2的抒发，何况不错促进脂滴的结合；同期，C/EBPα不错和C/EBPβ、PPARγ相结合，转机脂肪酸合成酶(FAS)的抒发[35-37]。揣摸， 过抒发NR4A1可能主要通过上调C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和AP2的抒发水平来促进山羊皮下脂肪细胞分化，何况， 赵莉鸽[38]的商酌标明，NR4A1的过抒发可减少神经系统细胞内淀粉样前体卵白代谢的居品含量，种植β分泌酶的含量，导致APP水解开释能量，进一次序控生物程度，同期也有商酌标明，NR4A1不错转机线粒体功能[39-41]，而线粒体又是产生能量和ATP合成的主要塞点，因此揣摸，NR4A1的过抒发也有可能通过转机ATP生化反映来进一次序节脂肪和脂肪酸的代谢，还需要通过体内和体外检修进一步揭示NR4A1在山羊皮下脂肪细胞分化中的深层机制。

本商酌克隆得到包含ORF的山羊NR4A1基因cDNA序列女同 porn，在山羊各个组织日常抒发，其中在背最长肌中相对抒发量最高；NR4A1在山羊皮下脂肪细胞分化60 h的抒发量最高；过抒发NR4A1后可能通过上调C/EBPα、C/EBPβ、LPL、PPARγ、SREBP1和AP2的抒发来促进山羊皮下脂肪细胞分化，商酌结果可为进一步叙述NR4A1基因调控山羊不同部位脂肪千里积的分子机理提供进犯的表面依据。

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