本期推送将和大家共享寡核苷酸中稀薄核苷酸的作用。在常见的 A、T、G、C、U 基础上，只是作念了少许改变，或是某个原子的取代全色网导航，或是某个基团的添加和缺失，关联词却给寡核苷酸性质带来比较大的变化，赋予寡核苷酸新的功能。

应用：

2'-F 是将核糖核苷酸的 2'-羟基替换为氟原子。1）ASO：ASO 即 anti-sense oligo nucleotide，是一种长度约在 12～30nt 的单链寡核苷酸片断，ASO 的骨架和碱基上平常含有修饰以增强其功能。ASO 主如果通过碱基互补配对与靶标 mRNA 诱导，导致 RNase H 剪切靶标 mRNA，从而扼制基因抒发；也有 ASO 通过扼制 ribosome 翻译卵白、编削 RNA splicing 等机制阐扬作用。

向 ASO 中每掺入一个 2'-F 修饰的核苷酸，ASO 与其靶标 RNA 诱导的 Tm 值可升高约 1.8℃，因此向 ASO 中引入 2'-F 可提升 ASO 与靶标的结协力，同期提升了 ASO 的核酸酶抗性。值得小心的是，咱们提到 ASO 作用机制依赖于 RNase H，而 RNase H 阐扬作用需要 RNA 的 2』-羟基，因此 2』-羟基处的修饰可能影响 ASO 的功能，为惩处这个矛盾，可接受 Gapmer 的设想神气：ASO 两头的序列接受 2』位修饰以提升核酸酶抗性和结协力，而中间未修饰部分可招募 RNase H 全色网导航[1]。

图片起原：《Therapeutic Oligo nucleotides Targeting Liver Disease: TTR Amyloidosis》

2）aptamer（核酸适配体）：符合添加 2'-F 修饰的核苷酸可提升 aptamer 的血清踏实性，并可能提升 aptamer 与靶标的诱导智力。举例 Macugen（pegaptanib）是一个靶向 VEGF 的 aptamer，被批准用于营救眼部血管疾病，比如老年黄斑变性。该药物在血清中的半衰期长达 18 小时（未经修饰的 aptamer 在血清中的半衰期平常唯一 5 分钟），何况磋议发现 2'-F 修饰提升了 aptamer 与靶标配体的结协力 [2]。

图片起原：《Pegaptanib， a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease》

(图 a pegaptanib 为红色碱基为 2』-OMe 修饰，蓝色碱基为 2』-F 修饰；图 b 为 pegaptanib 与 VEGF 诱导)

3）siRNA：磋议照旧标明 siRNA 的 sense-strand 上引入 2'-F 修饰不影响 RISC 复合物的激活，因此 2'-F 可修饰在 siRNA 中，提升 siRNA 在血清中的踏实性 [3]。

应用：2'-OMe 是将核糖核苷酸的 2'-羟基替换为甲氧基。1）2'-OMe 修饰不错提升 RNA 的核酸酶抗性，频繁被应用于 ASO、aptamer、siRNA 和 sgRNA 中。举例在 sgRNA 的 5』端和 3』端添加 2'-OMe 修饰与硫代修饰不错增多 sgRNA 的踏实性，从而提升其剪辑着力 [4]。

图片起原：《Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells》

（红旗处为修饰的碱基）

与 DNA/RNA 碱基互补配对比较，2'-OMe RNA/RNA 的碱基互补配对更接近于 RNA/RNA；因此在 ASO 中添加 2'-OMe 修饰可提升 ASO 对靶标 RNA 的结协力。 

2）有磋议发现，miRNA 不错被与之互补的 2'-OMe 修饰的 antisense oligo 扼制 [5]。 

3）也有磋议标明，将 2'-OMe 修饰遴选性的添加到 siRNA 中，在不裁汰其基因千里默智力的同期，不错减少动物体内因打针 siRNA 导致的细胞因子的产生，即不错裁汰 siRNA 的免疫原性 [6]。

应用： 

2'-O-MOE 与 2'-OMe 名字相近但本质不同，2'-O-MOE 指的是在核糖核苷酸的 2'-羟基上的氢替换为甲氧基乙基，这种修饰增多了寡核苷酸对于核酸酶的抗性。

2'-O-MOE 修饰在 ASO 和 aptamer 中应用凡俗。

举例 Inotersen 是一种序列 5』和 3』端修饰 2'-O-MOE 的 ASO 药物，其靶标是肝细胞 transthyretin（转甲状腺素）mRNA 的 3' 非翻译区，用于营救遗传性转甲状腺素淀粉样病变（一种冷酷的常染色体显性遗传病）。磋议标明，2'-O-MOE 修饰延长了药物的半衰期，提升了 ASO 药物与靶标 mRNA 的诱导智力 [7]。

图片起原：《Oligonucleotides to the (Gene) Rescue: FDA Approvals 2017–2019》

2'-O-MOE 修饰在 siRNA 5』端或 3』端时可能会影响其 RNA 侵略效应，关联词修饰在 siRNA 的中间位置则影响较小。

应用： 

LNA 称为锁核酸，是一个主体呋喃糖被「锁定」的双环结构。具体是通过 2'-O 和 4' 位之间添加亚甲基聚合，赋予原来柔性的呋喃核糖刚性；何况 LNA 误会成了经典的 A 型构象，更利于碱基堆积力，因此 LNA 对 DNA 或 RNA 证据出极好的诱导智力。

把柄 LNA 添加的位置相反与寡核苷酸序列的不同，每掺入一个 LNA，寡核苷酸的 Tm 值可提升 3～9℃。LNA 与 DNA 或 RNA 之间仍然解雇碱基互补配对原则。LNA 的添加并非越多越好，比如过多的 LNA 可能形成寡核苷酸分子里面的杂交。 

1）保举将 LNA 应用于需要高特异性的杂交检测中：双标探针，原位杂交探针等。

举例在 TaqMan PCR 中，对于富含 AT 的序列设想探针可能出现 Tm 值不够的风光，使用 LNA 不错在不延长探针的前提下，提升探针 Tm 值，幸免探针过长导致的高配景值。

有磋议标明，利用 qPCR 作念 SNP（单核苷酸多态性）检测时，与普通引物比较，使用 LNA 修饰的引物抓政生型序列和突变序列之间可取得更高的分辨度（ΔCt）[8]。

图片起原：《Enhanced Allele-Specific PCR Discrimination in SNP Genotyping Using 30 Locked Nucleic Acid (LNA) Primers》

2）利用 RNA 扼制功能的寡核苷酸：ASO，siRNA。 

应用： 

N6-Me-rA 等于咱们频繁听到的 m6A，具体指的是腺嘌呤核糖核苷酸的腺嘌呤碱基第 6 位的 N 发生甲基化，是近几年热点的磋议场所。m6A 是一类在真核生物 RNA 中凡俗存在的修饰，现在照旧在 mRNA、tRNA、rRNA 和 long non-coding RNA 等非编码 RNA 中齐不雅察到，这种修饰可影响 RNA 的剪接、翻译和踏实性等，从而在细胞分化、肿瘤发生和免疫反馈等好多生物学流程中阐扬垂危的调控作用。

有磋议标明，在环状 RNA 中引入 m6A 修饰可裁汰其免疫原性。

应用： 

N6-Me-dA 具体指的是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的腺嘌呤碱基第 6 位的 N 发生甲基化。比较于 m6A，N6-Me-dA 是一种存在于 DNA 上的修饰，率先只在原核生物，止境是细菌中被检测到；近来磋议标明，真核生物基因组中也存在 N6-Me-dA 的修饰。

在细菌中，N6-Me-dA 调控细胞周期、DNA 的错配开采、基因转录、抗生素耐药性和细菌与宿主间相互作用等 [9]。

在高档真核生物中，N6-Me-dA 的水平从胚胎发育期间最丰富到成体组织中显耀裁汰，教唆 N6-Me-dA 与发育、再生密切关联。近来也有磋议标明，小鼠脑中 N6-Me-dA 的水平与小鼠所处环境压力联系。

应用： 

5-Me-dC 指的是 5-甲基脱氧核糖胞苷，即在胞嘧啶脱氧核糖核苷酸碱基的第五位修饰甲基。5-Me-dC 与 dG 碱基互补配对，该修饰提升了双链的踏实性，向寡核苷酸中每掺入一个 5-Me-dC，寡核苷酸的 Tm 值可提升约 1.3℃。

1）添加到较短的 PCR 引物中。在一些稀暴戾况下，PCR 模板上引物诱导位点有限，或者 PCR 模板的二级结构可能阻难引物的诱导、扩增时，使用 5-Me-dC 修饰的 PCR 引物不祥不错取得比较好的扩增终局 [10]。

2）包含 CpG 基序的 ASO 给药到动物体内后，会激活 Toll-like receptor 9（Toll 样受体 9）而引起比较大的免疫反馈，磋议发现用 5-Me-dC 替代 dC 则不错大幅放松这种免疫反馈 [11]。

3）在真核生物中，5-Me-dC 是最常见的 DNA 甲基化修饰；哺乳动物中，大大批 5-Me-dC 发生在 CpG 位点，并由 DNA 甲基更始酶将甲基更始到胞嘧啶上进行修饰；5-Me-dC 在胚胎发育、肿瘤发生等流程中阐扬垂危作用。

4）在 cfDNA 甲基化测序中，5-Me-dC 可看成建库中使用的盘考引物的修饰，用于分析 DNA 甲基化的情况。 

应用： 

1）ddC 是一种双脱氧核糖核苷酸，属于脱氧胞苷（dC）的一样物。两者的区别在于 dC 核糖的 2' 位的羟基被 H 取代，而 ddC 核糖的 2' 和 3' 位的羟基均被 H 取代。因此 ddC 主要聚合在寡核苷酸的 3' 端，用于阻难寡核苷酸向后蔓延。

2）在 miRNA 测序建库中，使用 5'-rApp 修饰的寡核苷酸 adapter，这类 adapter 的 3' 端修饰 ddC，用以阻难 adapter 之间的相互聚合或分子内的环化 [12]。

图片起原：《Elimination of PCR duplicates in RNA-seq and small RNA-seq using unique molecular identifiers》

应用： 

dU 是嘧啶脱氧核糖核苷，属于尿嘧啶核苷的繁衍物。在细胞中 dU 看成 dC 的脱氨产物产生，脱氨流程由 AID 酶催化。尿嘧啶 DNA 糖基化酶不错水解单链 DNA 或双链 DNA 中 dU 的糖苷键，开释尿嘧啶，产生缺碱基位点。使得寡核苷酸链容易断裂。

1）在 qPCR 中，dU 可防欺侮：通过将 PCR 中的 dT 替换为 dU，qPCR 检测完成后，可使用尿嘧啶 DNA 糖基化酶将 PCR 产物降解，从而幸免每次 PCR 之间形成的交叉欺侮。

2）有磋议将 dU 掺入到探针中，用来进行短 DNA 片断的 qPCR 检测：将短 DNA 看成引物，含 dU 的探针看成模板，使短 DNA 片断进行蔓延取得一个允洽进行旧例 qPCR 的长片断，再用尿嘧啶 DNA 糖基化酶将含 dU 的探针消化幸免对后续 qPCR 的侵略，最终设想引物对包含短 DNA 的长片断进行 qPCR 检测 [13]。

图片起原：《Real-time PCR method for detection of short DNA using a deoxyuridine probe and application for detection of fomivirsen》 

应用： 

dI 即脱氧肌苷，属于核苷一样物，它在结构上一样鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，但碱基上穷乏 2-氨基；脱氧肌苷和 A、T、C、G 四种碱基均以两个氢键进行互补配对，因此脱氧肌苷频繁被用作通用碱基。关联词，脱氧肌苷对于 A、T、C、G 的诱导智力存在相反，从热力学踏实性上 I-C > I-A > I-G ≈ I-T，这种热力学的相反也会受到临近碱基的影响。

1）在用羼杂引物进行 PCR 作念突变时，为了研讨简并密码子的问题，频繁需要设想好多引物，将 dI 添加到寡核苷酸密码子的第三位（舞动碱基），不错裁汰引物的复杂度。

2）在 Dual priming oligonucleotide system（DPO，双引物寡核苷酸系统）的 PCR 中，dI 以 poly dI 的体式起到 linker 作用。DPO 系统的引物由三部分构成，较长片断的 5』端序列 Tm 值较高，优先与靶标序列诱导，踏实 DPO 引物与靶标退火才略；继而较短片断的 3』端诱导至靶标序列上，开动特异性蔓延；而聚合 5』和 3』端的 Poly-dI linker 在引物退火流程中，会形成泡状结构，该探针通过使引物两步退火，确保引物开动特异性扩增 [14]。

图片起原：《Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene》 

应用： 

rI 在结构上一样鸟嘌呤核糖核苷酸，但碱基上穷乏 2-氨基；rI 与 A、U、C、G 四种碱基进行互补配对。

在 tRNA 中 rI 存在于反密码子的舞动位置，这种修饰蔓延了 tRNA 可识别的三联体密码子；在 mRNA 转录时或转录后可发生 A-I 的剪辑，这种修饰影响了 RNA 的剪切和翻译；rI 对 mRNA 和 tRNA 功能的概述营用使其成为翻译着力和准确性的主要编削剂，有助于物种间卵白质组的千般性。 

应用： 

通过在寡核苷酸中引入 inverted dT，寡核苷酸不错被设想成 5'-5' 或 3'-3' 聚合。由于好多核酸酶作用于 5'-3' 磷酸二酯键，是以在寡核苷酸末端引入 inverted dT 不错违反核酸外切酶的降解。

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参考文件：

[1] Niemietz， C.， Chandhok， G.， & Schmidt， H. (2015). Therapeutic Oligonucleotides Targeting Liver Disease: TTR Amyloidosis. Molecules (Basel， Switzerland)， 20(10)， 17944–17975.

[2] Ng， E. W.， Shima， D. T.， Calias， P.， Cunningham， E. T.， Jr， Guyer， D. R.， & Adamis， A. P. (2006). Pegaptanib， a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease. Nature reviews. Drug discovery， 5(2)， 123–132.

[3] Muhonen， P.， Tennilä， T.， Azhayeva， E.， Parthasarathy， R. N.， Janckila， A. J.， Väänänen， H. K.， Azhayev， A.， & Laitala-Leinonen， T. (2007). RNA interference tolerates 2'-fluoro modifications at the Argonaute2 cleavage site. Chemistry & biodiversity， 4(5)， 858–873.

[4] Hendel， A.， Bak， R. O.， Clark， J. T.， Kennedy， A. B.， Ryan， D. E.， Roy， S.， Steinfeld， I.， Lunstad， B. D.， Kaiser， R. J.， Wilkens， A. B.， Bacchetta， R.， Tsalenko， A.， Dellinger， D.， Bruhn， L.， & Porteus， M. H. (2015). Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nature biotechnology， 33(9)， 985–989.

[5] Meister， G.， Landthaler， M.， Dorsett， Y.， & Tuschl， T. (2004). Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA (New York， N.Y.)， 10(3)， 544–550.

[6] Robbins， M.， Judge， A.， Liang， L.， McClintock， K.， Yaworski， E.， & MacLachlan， I. (2007). 2'-O-methyl-modified RNAs act as TLR7 antagonists. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy， 15(9)， 1663–1669.

[7] Rüger， J.， Ioannou， S.， Castanotto， D.， & Stein， C. A. (2020). Oligonucleotides to the (Gene) Rescue: FDA Approvals 2017-2019. Trends in pharmacological sciences， 41(1)， 27–41.

[8] Latorra， D.， Campbell， K.， Wolter， A.， & Hurley， J. M. (2003). Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3' locked nucleic acid (LNA) primers. Human mutation， 22(1)， 79–85.

[9] Iyer， L. M.， Zhang， D.， & Aravind， L. (2016). Adenine methylation in eukaryotes: Apprehending the complex evolutionary history and functional potential of an epigenetic modification. BioEssays : news and reviews in molecular， cellular and developmental biology， 38(1)， 27–40.

[10] Lebedev， Y.， Akopyants， N.， Azhikina， T.， Shevchenko， Y.， Potapov， V.， Stecenko， D.， Berg， D.， & Sverdlov， E. (1996). Oligonucleotides containing 2-aminoadenine and 5-methylcytosine are more effective as primers for PCR amplification than their nonmodified counterparts. Genetic analysis: biomolecular engineering， 13(1)， 15–21.

[11] Henry， S.， Stecker， K.， Brooks， D.， Monteith， D.， Conklin， B.， & Bennett， C. F. (2000). Chemically modified oligonucleotides exhibit decreased immune stimulation in mice. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics， 292(2)， 468–479.

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[13] Harikai， N.， Tanaka， Y.， Miyashita， S.， Zaima， K.， & Shinomiya， K. (2022). Real-time PCR method for detection of short DNA using a deoxyuridine probe and application for detection of fomivirsen. BioTechniques， 73(6)， 281–287.

[14] Chun， J. Y.， Kim， K. J.， Hwang， I. T.， Kim， Y. J.， Lee， D. H.， Lee， I. K.， & Kim， J. K. (2007). Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene. Nucleic acids research， 35(6)， e40. 

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