全色网导航 小改变,大功能——浅谈稀薄核苷酸的作用

发布日期:2024-10-29 07:15    点击次数:70

全色网导航 小改变,大功能——浅谈稀薄核苷酸的作用

本期推送将和大家共享寡核苷酸中稀薄核苷酸的作用。在常见的 A、T、G、C、U 基础上,只是作念了少许改变,或是某个原子的取代全色网导航,或是某个基团的添加和缺失,关联词却给寡核苷酸性质带来比较大的变化,赋予寡核苷酸新的功能。

应用:

2'-F 是将核糖核苷酸的 2'-羟基替换为氟原子。1)ASO:ASO 即 anti-sense oligo nucleotide,是一种长度约在 12~30nt 的单链寡核苷酸片断,ASO 的骨架和碱基上平常含有修饰以增强其功能。ASO 主如果通过碱基互补配对与靶标 mRNA 诱导,导致 RNase H 剪切靶标 mRNA,从而扼制基因抒发;也有 ASO 通过扼制 ribosome 翻译卵白、编削 RNA splicing 等机制阐扬作用。

向 ASO 中每掺入一个 2'-F 修饰的核苷酸,ASO 与其靶标 RNA 诱导的 Tm 值可升高约 1.8℃,因此向 ASO 中引入 2'-F 可提升 ASO 与靶标的结协力,同期提升了 ASO 的核酸酶抗性。值得小心的是,咱们提到 ASO 作用机制依赖于 RNase H,而 RNase H 阐扬作用需要 RNA 的 2』-羟基,因此 2』-羟基处的修饰可能影响 ASO 的功能,为惩处这个矛盾,可接受 Gapmer 的设想神气:ASO 两头的序列接受 2』位修饰以提升核酸酶抗性和结协力,而中间未修饰部分可招募 RNase H 全色网导航[1]。

图片起原:《Therapeutic Oligo nucleotides Targeting Liver Disease: TTR Amyloidosis》

2)aptamer(核酸适配体):符合添加 2'-F 修饰的核苷酸可提升 aptamer 的血清踏实性,并可能提升 aptamer 与靶标的诱导智力。举例 Macugen(pegaptanib)是一个靶向 VEGF 的 aptamer,被批准用于营救眼部血管疾病,比如老年黄斑变性。该药物在血清中的半衰期长达 18 小时(未经修饰的 aptamer 在血清中的半衰期平常唯一 5 分钟),何况磋议发现 2'-F 修饰提升了 aptamer 与靶标配体的结协力 [2]。

图片起原:《Pegaptanib, a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease》

(图 a pegaptanib 为红色碱基为 2』-OMe 修饰,蓝色碱基为 2』-F 修饰;图 b 为 pegaptanib 与 VEGF 诱导)

3)siRNA:磋议照旧标明 siRNA 的 sense-strand 上引入 2'-F 修饰不影响 RISC 复合物的激活,因此 2'-F 可修饰在 siRNA 中,提升 siRNA 在血清中的踏实性 [3]。

应用:2'-OMe 是将核糖核苷酸的 2'-羟基替换为甲氧基。1)2'-OMe 修饰不错提升 RNA 的核酸酶抗性,频繁被应用于 ASO、aptamer、siRNA 和 sgRNA 中。举例在 sgRNA 的 5』端和 3』端添加 2'-OMe 修饰与硫代修饰不错增多 sgRNA 的踏实性,从而提升其剪辑着力 [4]。

图片起原:《Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells》

(红旗处为修饰的碱基)

与 DNA/RNA 碱基互补配对比较,2'-OMe RNA/RNA 的碱基互补配对更接近于 RNA/RNA;因此在 ASO 中添加 2'-OMe 修饰可提升 ASO 对靶标 RNA 的结协力。 

2)有磋议发现,miRNA 不错被与之互补的 2'-OMe 修饰的 antisense oligo 扼制 [5]。 

3)也有磋议标明,将 2'-OMe 修饰遴选性的添加到 siRNA 中,在不裁汰其基因千里默智力的同期,不错减少动物体内因打针 siRNA 导致的细胞因子的产生,即不错裁汰 siRNA 的免疫原性 [6]。

应用: 

2'-O-MOE 与 2'-OMe 名字相近但本质不同,2'-O-MOE 指的是在核糖核苷酸的 2'-羟基上的氢替换为甲氧基乙基,这种修饰增多了寡核苷酸对于核酸酶的抗性。

2'-O-MOE 修饰在 ASO 和 aptamer 中应用凡俗。

举例 Inotersen 是一种序列 5』和 3』端修饰 2'-O-MOE 的 ASO 药物,其靶标是肝细胞 transthyretin(转甲状腺素)mRNA 的 3' 非翻译区,用于营救遗传性转甲状腺素淀粉样病变(一种冷酷的常染色体显性遗传病)。磋议标明,2'-O-MOE 修饰延长了药物的半衰期,提升了 ASO 药物与靶标 mRNA 的诱导智力 [7]。

图片起原:《Oligonucleotides to the (Gene) Rescue: FDA Approvals 2017–2019》

2'-O-MOE 修饰在 siRNA 5』端或 3』端时可能会影响其 RNA 侵略效应,关联词修饰在 siRNA 的中间位置则影响较小。

应用: 

LNA 称为锁核酸,是一个主体呋喃糖被「锁定」的双环结构。具体是通过 2'-O 和 4' 位之间添加亚甲基聚合,赋予原来柔性的呋喃核糖刚性;何况 LNA 误会成了经典的 A 型构象,更利于碱基堆积力,因此 LNA 对 DNA 或 RNA 证据出极好的诱导智力。

把柄 LNA 添加的位置相反与寡核苷酸序列的不同,每掺入一个 LNA,寡核苷酸的 Tm 值可提升 3~9℃。LNA 与 DNA 或 RNA 之间仍然解雇碱基互补配对原则。LNA 的添加并非越多越好,比如过多的 LNA 可能形成寡核苷酸分子里面的杂交。 

1)保举将 LNA 应用于需要高特异性的杂交检测中:双标探针,原位杂交探针等。

举例在 TaqMan PCR 中,对于富含 AT 的序列设想探针可能出现 Tm 值不够的风光,使用 LNA 不错在不延长探针的前提下,提升探针 Tm 值,幸免探针过长导致的高配景值。

有磋议标明,利用 qPCR 作念 SNP(单核苷酸多态性)检测时,与普通引物比较,使用 LNA 修饰的引物抓政生型序列和突变序列之间可取得更高的分辨度(ΔCt)[8]。

图片起原:《Enhanced Allele-Specific PCR Discrimination in SNP Genotyping Using 30 Locked Nucleic Acid (LNA) Primers》

2)利用 RNA 扼制功能的寡核苷酸:ASO,siRNA。 

应用: 

N6-Me-rA 等于咱们频繁听到的 m6A,具体指的是腺嘌呤核糖核苷酸的腺嘌呤碱基第 6 位的 N 发生甲基化,是近几年热点的磋议场所。m6A 是一类在真核生物 RNA 中凡俗存在的修饰,现在照旧在 mRNA、tRNA、rRNA 和 long non-coding RNA 等非编码 RNA 中齐不雅察到,这种修饰可影响 RNA 的剪接、翻译和踏实性等,从而在细胞分化、肿瘤发生和免疫反馈等好多生物学流程中阐扬垂危的调控作用。

有磋议标明,在环状 RNA 中引入 m6A 修饰可裁汰其免疫原性。

应用: 

N6-Me-dA 具体指的是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的腺嘌呤碱基第 6 位的 N 发生甲基化。比较于 m6A,N6-Me-dA 是一种存在于 DNA 上的修饰,率先只在原核生物,止境是细菌中被检测到;近来磋议标明,真核生物基因组中也存在 N6-Me-dA 的修饰。

在细菌中,N6-Me-dA 调控细胞周期、DNA 的错配开采、基因转录、抗生素耐药性和细菌与宿主间相互作用等 [9]。

在高档真核生物中,N6-Me-dA 的水平从胚胎发育期间最丰富到成体组织中显耀裁汰,教唆 N6-Me-dA 与发育、再生密切关联。近来也有磋议标明,小鼠脑中 N6-Me-dA 的水平与小鼠所处环境压力联系。

应用: 

5-Me-dC 指的是 5-甲基脱氧核糖胞苷,即在胞嘧啶脱氧核糖核苷酸碱基的第五位修饰甲基。5-Me-dC 与 dG 碱基互补配对,该修饰提升了双链的踏实性,向寡核苷酸中每掺入一个 5-Me-dC,寡核苷酸的 Tm 值可提升约 1.3℃。

麻豆av

1)添加到较短的 PCR 引物中。在一些稀暴戾况下,PCR 模板上引物诱导位点有限,或者 PCR 模板的二级结构可能阻难引物的诱导、扩增时,使用 5-Me-dC 修饰的 PCR 引物不祥不错取得比较好的扩增终局 [10]。

2)包含 CpG 基序的 ASO 给药到动物体内后,会激活 Toll-like receptor 9(Toll 样受体 9)而引起比较大的免疫反馈,磋议发现用 5-Me-dC 替代 dC 则不错大幅放松这种免疫反馈 [11]。

3)在真核生物中,5-Me-dC 是最常见的 DNA 甲基化修饰;哺乳动物中,大大批 5-Me-dC 发生在 CpG 位点,并由 DNA 甲基更始酶将甲基更始到胞嘧啶上进行修饰;5-Me-dC 在胚胎发育、肿瘤发生等流程中阐扬垂危作用。

4)在 cfDNA 甲基化测序中,5-Me-dC 可看成建库中使用的盘考引物的修饰,用于分析 DNA 甲基化的情况。 

应用: 

1)ddC 是一种双脱氧核糖核苷酸,属于脱氧胞苷(dC)的一样物。两者的区别在于 dC 核糖的 2' 位的羟基被 H 取代,而 ddC 核糖的 2' 和 3' 位的羟基均被 H 取代。因此 ddC 主要聚合在寡核苷酸的 3' 端,用于阻难寡核苷酸向后蔓延。

2)在 miRNA 测序建库中,使用 5'-rApp 修饰的寡核苷酸 adapter,这类 adapter 的 3' 端修饰 ddC,用以阻难 adapter 之间的相互聚合或分子内的环化 [12]。

图片起原:《Elimination of PCR duplicates in RNA-seq and small RNA-seq using unique molecular identifiers》

应用: 

dU 是嘧啶脱氧核糖核苷,属于尿嘧啶核苷的繁衍物。在细胞中 dU 看成 dC 的脱氨产物产生,脱氨流程由 AID 酶催化。尿嘧啶 DNA 糖基化酶不错水解单链 DNA 或双链 DNA 中 dU 的糖苷键,开释尿嘧啶,产生缺碱基位点。使得寡核苷酸链容易断裂。

1)在 qPCR 中,dU 可防欺侮:通过将 PCR 中的 dT 替换为 dU,qPCR 检测完成后,可使用尿嘧啶 DNA 糖基化酶将 PCR 产物降解,从而幸免每次 PCR 之间形成的交叉欺侮。

2)有磋议将 dU 掺入到探针中,用来进行短 DNA 片断的 qPCR 检测:将短 DNA 看成引物,含 dU 的探针看成模板,使短 DNA 片断进行蔓延取得一个允洽进行旧例 qPCR 的长片断,再用尿嘧啶 DNA 糖基化酶将含 dU 的探针消化幸免对后续 qPCR 的侵略,最终设想引物对包含短 DNA 的长片断进行 qPCR 检测 [13]。

图片起原:《Real-time PCR method for detection of short DNA using a deoxyuridine probe and application for detection of fomivirsen》 

应用: 

dI 即脱氧肌苷,属于核苷一样物,它在结构上一样鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸,但碱基上穷乏 2-氨基;脱氧肌苷和 A、T、C、G 四种碱基均以两个氢键进行互补配对,因此脱氧肌苷频繁被用作通用碱基。关联词,脱氧肌苷对于 A、T、C、G 的诱导智力存在相反,从热力学踏实性上 I-C > I-A > I-G ≈ I-T,这种热力学的相反也会受到临近碱基的影响。

1)在用羼杂引物进行 PCR 作念突变时,为了研讨简并密码子的问题,频繁需要设想好多引物,将 dI 添加到寡核苷酸密码子的第三位(舞动碱基),不错裁汰引物的复杂度。

2)在 Dual priming oligonucleotide system(DPO,双引物寡核苷酸系统)的 PCR 中,dI 以 poly dI 的体式起到 linker 作用。DPO 系统的引物由三部分构成,较长片断的 5』端序列 Tm 值较高,优先与靶标序列诱导,踏实 DPO 引物与靶标退火才略;继而较短片断的 3』端诱导至靶标序列上,开动特异性蔓延;而聚合 5』和 3』端的 Poly-dI linker 在引物退火流程中,会形成泡状结构,该探针通过使引物两步退火,确保引物开动特异性扩增 [14]。

图片起原:《Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene》 

应用: 

rI 在结构上一样鸟嘌呤核糖核苷酸,但碱基上穷乏 2-氨基;rI 与 A、U、C、G 四种碱基进行互补配对。

在 tRNA 中 rI 存在于反密码子的舞动位置,这种修饰蔓延了 tRNA 可识别的三联体密码子;在 mRNA 转录时或转录后可发生 A-I 的剪辑,这种修饰影响了 RNA 的剪切和翻译;rI 对 mRNA 和 tRNA 功能的概述营用使其成为翻译着力和准确性的主要编削剂,有助于物种间卵白质组的千般性。 

应用: 

通过在寡核苷酸中引入 inverted dT,寡核苷酸不错被设想成 5'-5' 或 3'-3' 聚合。由于好多核酸酶作用于 5'-3' 磷酸二酯键,是以在寡核苷酸末端引入 inverted dT 不错违反核酸外切酶的降解。

 

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参考文件:

[1] Niemietz, C., Chandhok, G., & Schmidt, H. (2015). Therapeutic Oligonucleotides Targeting Liver Disease: TTR Amyloidosis. Molecules (Basel, Switzerland), 20(10), 17944–17975.

[2] Ng, E. W., Shima, D. T., Calias, P., Cunningham, E. T., Jr, Guyer, D. R., & Adamis, A. P. (2006). Pegaptanib, a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease. Nature reviews. Drug discovery, 5(2), 123–132.

[3] Muhonen, P., Tennilä, T., Azhayeva, E., Parthasarathy, R. N., Janckila, A. J., Väänänen, H. K., Azhayev, A., & Laitala-Leinonen, T. (2007). RNA interference tolerates 2'-fluoro modifications at the Argonaute2 cleavage site. Chemistry & biodiversity, 4(5), 858–873.

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[6] Robbins, M., Judge, A., Liang, L., McClintock, K., Yaworski, E., & MacLachlan, I. (2007). 2'-O-methyl-modified RNAs act as TLR7 antagonists. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy, 15(9), 1663–1669.

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[13] Harikai, N., Tanaka, Y., Miyashita, S., Zaima, K., & Shinomiya, K. (2022). Real-time PCR method for detection of short DNA using a deoxyuridine probe and application for detection of fomivirsen. BioTechniques, 73(6), 281–287.

[14] Chun, J. Y., Kim, K. J., Hwang, I. T., Kim, Y. J., Lee, D. H., Lee, I. K., & Kim, J. K. (2007). Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene. Nucleic acids research, 35(6), e40. 

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