羊肉的品性特质联系日益受到爱好，肉质性状包括pH、肉色、大理石纹、系水力、嫩度、多汁性和肌内脂肪含量等，在影响肉质的繁密身分中，肌内脂肪含量是影响羊肉肉质性状的进击身分。肌内脂肪含量受脂肪细胞的数目以及体积影响，在热量摄入加多的情况下清野 裸舞，白色脂肪组织和会过加多现存脂肪细胞的大小和通过前体脂肪细胞酿成新的脂肪细胞而扩大，从而导致脂肪细胞数目加多[1-3]。肌内脂肪千里积受多种身分过问，连年来，转录因子对脂肪千里积调控的联系越来越多。

核受体超家眷是一大群移动机体生理稳态与特定相关的转录因子。固然该组中的好多核受体已被充分表征，然而存在大皆且不停加多的具有未知功能或配体的受体，称为孤儿核受体[4-6]。核受体家眷成员NR4A1(nuclear receptor subfamily 4 group a member 1)，也被称为Nur77、TR3和NGFI-B，分散在多种细胞内，具有功能各类性，对多种生理流程皆说明着进击作用[7]，包括细胞增殖和凋一火等生命活动[8-12]。在细胞凋一火的联系中，Liu等[13]的联系缚束标明，过问素刺激基因12a(ISG12a)过火相互作用伴侣NR4A1均参与肿瘤坏死因子相关凋一火素质配体(TRAIL)介导的肝癌细胞凋一火；Yang等[14]联系发现，Nur77通过与谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)启动子上的特定联结位点联结来增强GPX1启动子的反式激活，从而上调GPX1的抒发，进而保护胰腺β细胞凋一火。同期，NR4A1也有抗细胞增殖的作用，有联系讲授，NR4A1/3通过径直联结造血特异性C/EBPα增强剂并激活C/EBPα转录，部分地通过激活C/EBPα驱动的抗增殖汇集来阻抑HSC增殖[15]；Hedrick等[16]联系发现，在横纹肌赘瘤(RMS)中过抒发能够过问Nur77或用Nur77拮抗剂(DIM-C-pPhOH)均对RMS细胞有抗增殖作用。NR4A1也具有移动线粒体的功能，Zhu等[17]联系发现，NR4A1/DNA-PKcs/p53阶梯参与了乳酸加快血管钙化的机制，部分原因是过度的Drp介导的线粒体裂变和线粒体促凋一火卵白基因相关的线粒体穷乏；Sheng等[18]联系发现，NR4A1过问打断了线粒体外膜受体相关的线粒体裂变，并取消了帕金森介导的线粒体归并，从而减少了高血糖介导的线粒体毁伤，改善了肾功能。线粒体是有氧呼吸产生能量的主要所在，而上述联系标明，NR4A1不错移动线粒体的功能，标明NR4A1可能与能量稳态联系。在脂肪方面的联系，秦丹丹[19]联系发现，过抒发NR4A1可扼制小鼠的脂肪细胞分化，同期有联系标明，过问Nur77可下调HFD饲喂雌性小鼠白色脂肪组织的乙酰辅酶A羧化酶α(ACCα)和脂肪酸(FAS)，进一方法控脂肪代谢[20]，Jung等[21]联系发现，用Nur77扼制剂扼制3T3-L1前脂肪细胞的脂肪酿成，伴跟着在脂肪酿成早期发生的有丝分裂克隆扩增(MCE)减少， 以及MCE和细胞周期符号物所需的基因抒发镌汰；Yi等[22]联系得到，NR4A1的低抒发不错镌汰2型糖尿病小鼠的体重、血脂和血糖，况兼脂肪细胞的大小和脂滴的体积相应减小。上述联系标明，过抒发NR4A1不错扼制脂肪细胞分化，过问其抒发相似会扼制脂肪细胞的分化，但其具体调控机制需要进一步接头。当今尚未见NR4A1对山羊皮下脂肪细胞影响的联系报说念。

基于上述的不同联系缚束，本磨真金不怕火在克隆山羊NR4A1 cDNA序列的基础上，欺诈qPCR工夫检测NR4A1基因在山羊不同组织和不同分化阶段皮下脂肪细胞中的抒发模式，况兼接头过抒发NR4A1对山羊皮下脂肪细胞的影响，为进一步联系NR4A1基因在皮下脂肪细胞分化中的作用提供基础数据，并为最终敷陈其调控山羊皮下脂肪千里积的分子机制奠定基础。

本联系以1周岁健康的简州大耳羊(n=5)为磨真金不怕火动物，清晨空心24 h，宰杀后采集心、肝、脾、肺、肾、皮脂、腹脂、背最长肌、股二头肌和臂三头肌等组织。

Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司；Kpn Ⅰ和Not Ⅰ内切酶购自Thermo公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit、Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司。

1.3.1 山羊NR4A1克隆及生物信息学分析 　　凭证GenBank中的山羊掂量序列(XM_018047733.1)遐想克隆引物(表 1)。先用RT-PCR工夫对NR4A1基因进行克隆，PCR响应体系：5倍稀释的背最长肌cDNA模板1 μL，12.5 μL的2×GC Rich-PCR，1 μL的正义链引物(10 μmol·μL-1)和1 μL的反义链引物(10 μmol·μL-1)，补充ddH2O至25 μL。克隆方法: 98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，64 ℃退火15 s，72 ℃蔓延40 s，35个轮回；72 ℃蔓延5 min；4 ℃保存。PCR产品用2% 琼脂糖凝胶进行电泳，用Gel Extraction Kit回收盘算片断；构建pClone007载体后移动DH5α感受态细胞；挑取阳性菌落进行PCR果决并提真金不怕火质粒，然后测序。

通过ProtParam在线分析编码卵白的理化性质；通过NCBI网站的ORF Finder寻找通达阅读框(open reading frame， ORF)；选用STRING掂量NR4A1卵白与其他卵白的相互作用汇集；使用Conserved Domains (CD)掂量卵白结构域。

1.3.2 山羊NR4A1的组织抒发分析 　　凭证上述克隆得到的NR4A1 CDS区序列遐想qPCR引物，凭证山羊不同内参基因的筛选，罗致泛抒发转录因子(UXT)和肽酰脯氨基顺反异构酶(PPIB)为内参基因[23]，qPCR的引物信息如表 1所示。以上述采集的山羊组织样进行总RNA提真金不怕火和cDNA的合成，以分析NR4A1基因在山羊不同组织的相对抒发水平。通过qPCR工夫检测NR4A1基因在山羊不同组织的抒发量，qPCR体系: SYBR ® Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，5倍稀释的cDNA 1 μL，1 μL的正义链引物(10 μmol·μL-1) 和1 μL的反义链引物(10 μmol·μL-1)，补充ddH2O至20 μL。qPCR方法: 95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s清野 裸舞，72 ℃蔓延30 s，共39个轮回。

1.3.3 山羊NR4A1的细胞时序抒发分析 　　在无菌条目下从7日龄的简州大耳羊均分离出山羊的皮下脂肪组织(n=1)。先将分离出的肌肉组织切碎，用PBS冲洗3次，然后加入2倍体积的Ⅱ型胶原酶，接下来通过补充有10% 胎牛血清(FBS)疏通体积的DMEM / F12(Hyclone)圮绝消化，并分散通过400目筛。将悬浮液以2 000 r·min-1离心5 min，加入红细胞(RBC)溶化液，然后以2 000 r·min-1离心5 min。皮下脂肪细胞的千里淀被DMEM/F12(Hyclone)和FBS重悬。将皮下前体脂肪细胞接种在细胞培养瓶中，4 h后更换培养基，每2 d更换1次培养基。当传至F3代的细胞长至80%交融时，添加油酸素质液进行分化，并分散汇集第0、12、36、60和96 h的细胞。用qPCR方法分析NR4A1基因在山羊不同时分段皮下脂肪细胞的相对抒发水平。响应体系同“1.3.2”。

1.3.4 过抒发载体的构建 　　欺诈上述克隆得到的NR4A1 CDS区遐想亚克隆引物，NR4A1-S: CGGGGTACC ATGCCCTGTATCCAAGCCC，NR4A1-A: ATAAGAATGCGGCCGCTCAGAAGGGCAG TGTGTCC。以上述提真金不怕火的质粒为模板，以上述遐想的引物进行PCR扩增，将片断连合到19T载体后测序，质粒提真金不怕火纯化后用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，胶回收产品欺诈T4连合酶连合，之后移动到DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落并进行PCR果决，对果决正确的菌落提真金不怕火质粒进行测序。

1.3.5 NR4A1过抒发效果以及细胞方式学的检测(油红O染色) 　　欺诈“1.3.3”的方法，细胞传至F3代时，加入适量载体，空缺磨真金不怕火组以空载体感染皮下前体脂肪细胞，磨真金不怕火组以pcDNA3.1-NR4A1感染皮下前体脂肪细胞，感染2 d后汇集细胞。转染体系：100 μL opti，1.5 μL Lipofectamine 3000，500 ng pcDNA3.1-NR4A1。

通过方式学(油红O染色)检测转染过抒发载体后山羊皮下脂肪细胞的脂质含量变化情况。将油红O液加入蒸馏水配成油红O染色液，皮下脂肪细胞用10%甲醛溶液固定30 min后移除甲醛溶液，并用200 μL油红O染色液浸泡，染色后用PBS洗涤，于显微镜下不雅察山羊皮下脂肪细胞的脂滴方式。临了用250 μL异丙醇提真金不怕火细胞内脂质，并测量490 nm处的吸光度。

1.3.6 过抒发NR4A1对脂肪分化符号基因抒发的影响 　　欺诈qPCR工夫检测过抒发NR4A1对脂肪分化符号基因抒发量的影响。响应体系参照“1.3.2”。

1.3.7 统计分析 　　用“平均值±表率差(Mean±SD)”的形貌来示意数据，用2-ΔΔCt方法对qPCR定量数据进行分析[24]。通过SPSS 15.0软件进行显耀性分析和多重比较，当P < 0.01时以为互异极显耀。

本磨真金不怕火得手克隆得到山羊NR4A1基因CDS区序列，长度为1 797 bp(登录号为MN19754 4)。经过ORF Finder分析发现，山羊NR4A1的ORF为1 797 bp，编码598个氨基酸，不自由指数为60.06，亲水性的平均值为－0.269，表面等电点是6.85，带负电荷的氨基酸残基总额为58个，带正电荷的氨基酸残基总额为57个，通过CD在线软件分析得到山羊NR4A1具有1个锌指结构，1个DNA结构位点。山羊与绵羊的亲缘关系最近，与原鸡属关系最远，基本合适生物进化论(图 1A)；山羊的氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列相似性最高，其次为东说念主，相似性最低为原鸡属(图 1B)。

本磨真金不怕火检测了NR4A1在山羊不同组织中的相对抒发水平。以UXT为内参，心组织样本为校准样本，得到NR4A1基因在组织中的抒发模式，发现NR4A1在山羊肺组织中抒发较高(P < 0.01)，在山羊背最长肌中抒发最高(P < 0.01)，在总计被检测10种组织中均有抒发(图 2)。

为了赢得NR4A1基因在山羊皮下脂肪细胞的抒发模式，本磨真金不怕火还检测了NR4A1在山羊不同时分段皮下脂肪细胞中的抒发量，NR4A1基因在皮下脂肪细胞分化0~60 h的抒发量渐渐高涨，在60 h达到最高(P < 0.01)，60 h后运行下落(图 3)。

欺诈NR4A1过抒发载体检测其对山羊皮下前体脂肪细胞的影响，qPCR完毕领略，与对照组比较，NR4A1基因抒发量上调了5 493倍(图 4A)。油红O染色领略，与对照组比较，过抒发NR4A1后清爽促进山羊皮下脂肪细胞脂质集结(图 4C)，况兼油红O染色提真金不怕火完毕领略，过抒发后OD值极显耀升高(P < 0.01，图 4B)。

为了进一步敷陈山羊NR4A1对皮下脂肪细胞分化的调控机制，本联系检测了过抒发NR4A1对脂肪细胞相关基因相对抒发水平的影响。完毕领略，过抒发山羊NR4A1后C/EBPα、C/EBPβ、LPL、PPARγ、SREBP1、AP2在山羊皮下脂肪细胞中的抒发量显耀高涨(P < 0.05，图 5)。

本联系得手克隆了山羊NR4A1基因CDS区序列，通过STRING软件分析发现， FOS、AKT2卵白与NR4A1互作，Kokoroishi等[25]联系报说念，FOS不错促进TGF-β1介导的信号传导，进一方法节脂肪分化；Pang等[26]联系标明，AKT2不错扼制脂肪的生成，由此推敲，NR4A1基因可能与脂肪和脂肪酸代谢调控密切相关。为杰出到NR4A1在山羊的组织特异性，因此本磨真金不怕火联系了NR4A1在山羊的组织抒发模式，完毕得到，NR4A1在背最长肌中抒发水平最高，在肺组织中抒发次之，在总计被检测的山羊10种组织中均有抒发。完毕与其他学者在其他物种中的报说念存在相似或不同之处，Liu等[27]联系发现，NR4A1在猪的肝、胃和肌肉等组织中的相对抒发水平很低；Nakai等[28]联系发现，NR4A1在东说念主类胎儿肌肉和成东说念主肝、大脑和甲状腺中等闲抒发。基于上述报说念联结本实验室完毕推敲，NR4A1基因组织抒发具有物种和组织特异性。

本联系发现，NR4A1在山羊皮下前体脂肪细胞分化中呈先高涨后下落的趋势，且过抒发NR4A1促进山羊皮下脂肪细胞的分化，推敲NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪细胞分化的正调控因子。与本磨真金不怕火完毕一致的是，Fumoto等[29]发现，NR4A1在3T3-L1细胞中瞬时过抒发会促进脂质的蕴蓄。然而，Veum等[30]联系发现，NR4A1在东说念主原代前体脂肪细胞分化时分下调，而本联系发现，NR4A1在山羊脂肪细胞前期分化上调，而在60 h后才出现下调的风景；况兼，Qin等[31]联系标明，过抒发NR4A1通过增强GATA联结卵白2(GATA2)和p53的抒发扼制小鼠脂肪细胞的分化和脂质蕴蓄；Chao等[32]发现，过抒发NR4A1不错扼制3T3-F442A前体脂肪细胞的分化。上述这些报说念与本联系的完毕存在不同之处，由此推敲，NR4A1基因在不同物种的脂肪细胞调控流程中可能存在物种特异性。

本联系进一步检测了过抒发NR4A1对山羊脂肪细胞分化符号基因抒发的影响，完毕领略，过抒发NR4A1后脂肪分化符号基因的相对抒发量高涨。能量代谢的主要方法是富含三酰基甘油的脂卵白(TRL)水解，开释可使用或存储的脂肪酸，这是通过在血管内皮的“联结脂解部位” LPL终了的[33]；PPARγ是脂肪酿成的主要素质剂，C/EBPβ是素质脂肪生成的早期转录因子，它通过移动其附进启动子元件的转录来激活PPARγ，而PPARγ是脂肪细胞分化的正移动剂[34]，在之前的一些报说念中，C/EBPα均以被讲授为脂肪细胞分化的关键基因，此外，它还不错移动AP2的抒发，况兼不错促进脂滴的集结；同期，C/EBPα不错和C/EBPβ、PPARγ相联结，移动脂肪酸合成酶(FAS)的抒发[35-37]。推敲， 过抒发NR4A1可能主要通过上调C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和AP2的抒发水平来促进山羊皮下脂肪细胞分化，况兼， 赵莉鸽[38]的联系标明，NR4A1的过抒发可减少神经系统细胞内淀粉样前体卵白代谢的产品含量，进步β分泌酶的含量，导致APP水解开释能量，进一方法控生物进度，同期也有联系标明，NR4A1不错移动线粒体功能[39-41]，而线粒体又是产生能量和ATP合成的主要所在，因此推敲，NR4A1的过抒发也有可能通过移动ATP生化响应来进一方法节脂肪和脂肪酸的代谢，还需要通过体内和体外磨真金不怕火进一步揭示NR4A1在山羊皮下脂肪细胞分化中的深层机制。

本联系克隆得到包含ORF的山羊NR4A1基因cDNA序列清野 裸舞，在山羊各个组织等闲抒发，其中在背最长肌中相对抒发量最高；NR4A1在山羊皮下脂肪细胞分化60 h的抒发量最高；过抒发NR4A1后可能通过上调C/EBPα、C/EBPβ、LPL、PPARγ、SREBP1和AP2的抒发来促进山羊皮下脂肪细胞分化，联系缚束可为进一步敷陈NR4A1基因调控山羊不同部位脂肪千里积的分子机理提供进击的表面依据。

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